第134章 黎明前的测序
「重点是，防止环境里的RNA酶降解样本。」
江河严肃道：「你们是我亲自教出来的，我对你们的实验规范有绝对的信心，今晚的操作，每一步都必须严格按照我教的规范来，不许有任何多余的动作，听明白了吗？」
「明白！」陆晓林年纪最长，第一个出声回应。
「明白了老江，你说咋干就咋干。」陈浩拍了拍脸，让自己彻底清醒。
「去更衣室，穿两层隔离衣，戴双层乳胶手套，N95口罩，护目镜，进核心区。」
淩晨3:15。
柯正提着一个密封的生物安全转运箱来到了实验室门口。
他把箱子交给江河：「江河，这是马克的深部支气管肺泡灌洗液，已经加了裂解液灭活了。」
「好。」
江河接过箱子，转身刷卡进入实验室核心区，立刻说道：
「第一组，陈浩、向晚，你们负责配制试剂，所有的DEPC水、无水乙醇、异丙醇，全部重新开封新的，确保绝对无RNA酶污染，操作台用RNaseZap喷洒擦拭两遍。」
「第二组，程溪瑶、唐培，你们负责给所有的移液枪换上带滤芯的枪头，准备好离心管和冰盒。」
「师兄，亦舟，你们俩配合我，准备过柱子提取。」
江河站在超净工作台前，将转运箱打开，取出装有灭活样本的冻存管。
「开始。」
实验室内。
严肃，高效。
这群年纪轻轻的学生，此刻展现出了惊人的纪律性。
这就是培训的成果！
江河拿起一把P1000的移液枪，套上带滤芯的枪头。
「加入Trizol试剂，1毫升。」
将样本移入新的离心管中，注入Trizol。
透明的液体瞬间混合。
「室温静置5分钟，让核蛋白复合体彻底解离。」
江河看了一眼墙上的挂锺。
五分钟一到。
「加氯仿，0.2毫升。」
「盖紧管盖，剧烈振荡15秒。」
「静置3分钟。」
顾亦舟在一旁已经打开了高速冷冻离心机的盖子，温度已经预冷到了4℃。
「放入离心机，配平，12000转，15分钟。」
这15分钟极其漫长。
「滴——」
离心机停止。
江河小心翼翼取出离心管。
在冷光的照射下，管内的液体清晰地分成了三层：
底层是红色的酚氯仿相，中间是一层薄薄的白色蛋白交界面，最上层是无色的水相。
所有的病毒RNA，都溶解在这最上层的无色水相中。
江河深吸了一口气，换了一把P200的移液枪。
这一步是整个提取过程中最关键的一步。
如果吸到了中间的蛋白层或者底层的有机相，整个样本就废了。
他将手肘支撑在台面上，按下移液枪的按钮。
枪尖精准悬停在无色水相的中央，缓缓吸取了400微升的液体，移入一个全新的无酶离心管中。
全程，江河的手没有一丝颤抖。
外科医生的定力，在这一刻展现得淋漓尽致。
陆晓林在旁边看得头皮发麻。
——哪怕是浸淫实验室多年的老研究员，悬空吸取水相时也难免会有细微的晃动，但江河的手就像是被焊死了一样，稳得可怕。
「加入等体积的异丙醇，陈浩，递冰盒。」
「加入等体积的异丙醇，陈浩，递冰盒。」
样本在冰上静置了10分钟後，再次放入冷冻离心机。
12000转，10分钟。
再次取出时，管底出现了一点点半透明胶状沉淀。
「RNA沉淀出来了。」程溪瑶隔着护目镜，眼睛亮了起来。
江河：「弃上清，加1毫升75%的冰乙醇洗涤沉淀。」
轻轻悬浮沉淀後，第三次离心。
7500转，5分钟。
最後，用移液枪极其小心地吸走所有的乙醇液体，将离心管敞口放置在超净台的通风处。
「风乾5分钟，不能干透，否则很难溶解。」
五分钟後，江河加入20微升RNase-free的水，轻轻吹打。
「去测浓度。」江河把样本递给陆晓林。
陆晓林拿着样本走到NanoDrop分光光度计前，取了一微升滴在检测基座上，放下悬臂。
电脑屏幕上立刻跳出一条曲线。
「浓度120ng\/μl，A260\/280比值2.02。」陆晓林声音迅速，「师弟，提取极其完美！纯度极高，没有蛋白和苯酚污染！」
陈浩几个人长长地松了一口气，互相对视了一眼。
做到了！
江河毫不犹豫，道：「立刻进行逆转录，RNA极易降解，必须马上把它变成稳定的A。」
「引物用什麽？」陆晓林问。
「用随机六聚体引物（RandomHexamers）做全转录本的逆转录。」
江河走到冰箱前，拿出逆转录试剂盒：「不需要特异性引物，我们在PCR阶段再用甲流通用的HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）保守区引物去钓出目标片段。」
看着手里的试剂，江河眼神微动。
其实，如果这真的是一种完全未知的全新病毒，今晚的这几个小时根本连门槛都摸不到。
光是引物设计就能卡死全中国最顶尖的实验室两周时间。
但他不一样。
他记得H1N1的基因图谱，也知道它的外膜蛋白弱点，包括它最容易被哪种引物扩增。
基本就等同於，拿着标准答案，反向推导解题步骤。
所以效率才能这麽高。
逆转录反应体系配制完毕。
放入PCR仪。
42℃孵育60分钟，70℃加热5分钟灭活逆转录酶。
淩晨5:30。
逆转录完成。
极其脆弱的RNA终於变成了相对稳定的DNA。
「准备PCR扩增反应。」
「我们要分别扩增它的HA基因、NA基因、M基因以及PB1基因片段。」
PCR反应板在江河等人的熟练操作下加样完毕。
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